丙酮酸羧化酶（PC）活性檢測試劑盒說明書

微量法

注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。

貨號: BC0735

規(guī)格: 100T/96S

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑三：臨用前加入3 mL蒸餾水溶解；可分裝后-20℃保存2周，避免反復凍融；

2、 試劑四：臨用前加入2 mL蒸餾水溶解；可分裝后-20℃保存2周，避免反復凍融；

3、 試劑六：臨用前加入0.13mL試劑六稀釋液溶解，可分裝后-20℃保存4周，避免反復凍融；

4、 試劑六工作液：臨用前根據樣本量按試劑六：試劑六稀釋液=0.01mL：0.3mL（共0.31mL，約15T）的比例進行配制，現用現配，當天用完；

5、 工作液的配制：按照試劑二：試劑三：試劑四=2:1:1的體積比例充分混勻，現用現配。

產品說明：

丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC，EC 6.4.1.1)廣泛存在于動物、霉菌和酵母的線粒體中，但在植物體和大部分細菌中卻不含此酶。是供給草酰乙酸的主要補充反應，是糖異生過程的第一個限速酶。

PC不可逆的催化丙酮酸、ATP、CO₂和水生成草酰乙酸、ADP和Pi，蘋果酸脫氫酶進一步催化草酰乙酸和 NADH生成蘋果酸和NAD⁺，在340nm下測定NADH氧化速率，即可反映PC活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器用品：

紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、微量石英比色皿/96孔UV板、可調式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟;

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1、 取約0.1g組織或收集500萬細胞，加入1.0 mL提取液，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、 4℃1000g離心10min。將上清液移至另一離心管中，4℃11000g離心15min。

3、 上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的PC（此步可選做，可以判斷線粒體提取效果）。

4、 在沉淀中加入1mL提取液，超聲波破碎（功率200W，超聲5秒，間隔10秒，重復12次），用于PC活性測定，并且用于蛋白含量測定。

二、測定步驟

1、 分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至340nm，蒸餾水調零。

2、 試劑一用前37℃孵育15min。

3、 操作表：

三、PC酶活計算

1. 按微量石英比色皿計算：

單位的定義：每毫克蛋白每分鐘消耗1 nmol 的NADH定義為一個酶活力單位。

PC酶活（U/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×Cpr）÷T= 1607×ΔA÷Cpr

ε：NADH摩爾消光系數，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應體系總體積，2×10^-4L；V樣：反應體系中樣本體積，0.01mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；T：反應時間：2min。

2. 按96孔UV板計算：

將上述計算公式中的d-1cm改為d-0.6cm進行計算即可。

注意事項：

1. 為保證實驗結果的準確性，需先取1-2個樣做預實驗，ΔA大于0.8時（96孔UV板測定時ΔA大于0.5時），建議將粗酶液用提取液稀釋后再進行測定。當ΔA小于0.01時，可以延長反應時間（5min或10min）來測定。

2. 空白管為檢測各試劑組分質量的檢測孔，正常情況下，變化不超過0.05。

3. 樣本的蛋白濃度需自行測定，由于提取液中含有較高的蛋白濃度（約1mg/mL），所以測定樣本蛋白濃度時需扣除提取液自身蛋白濃度。

4. 推薦使用樣本蛋白濃度計算酶活，若用樣本質量計算，則需加測胞漿提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方為總酶活。

5. 本試劑盒試劑足夠完成100管反應。

6. 附:使用樣本重量計算公式：（樣本檢測數為100T/48S）

（1）按微量石英比色皿計算：

A、上清中PC活力的計算:

按樣本質量計算：

酶活定義：每克樣本每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

PC酶活（U/g質量）=ΔA1÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T = 1607×ΔA1÷W

ΔA1：上清測定值；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應體系總體積，2×10^-4L；V樣：反應體系中樣本體積，0.01mL；V提?。杭尤氲奶崛∫后w積，1mL；T：反應時間：2min；W：樣本質量，g。

B、沉淀中PC活力的計算:

按樣本質量計算：

酶活定義：每克樣本每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

PC酶活（U/g質量）=ΔA2÷（ε×d）×109×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T = 1607×ΔA2÷W

ΔA2：上清測定值；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應體系總體積，2×10^-4L；V樣：反應體系中樣本體積，0.01mL；V提?。撼恋碇貞殷w積，1mL；T：反應時間：2min；W：樣本質量，g。

C、樣本PC總活力的計算:

樣本PC總活力即為上清中PC活力與沉淀中PC活力之和。

按樣本質量計算：

PC（U/g 質量）=1607×ΔA1÷W+1607×ΔA2÷W。

（2）按96孔UV板計算：

將上述計算公式中的d-1cm改為d-0.6cm進行計算即可。

實驗實例

1、 取0.1g兔心組織加入1mL提取液進行勻漿研磨，用提取液稀釋上清100倍，稀釋沉淀4倍，之后按照測定步驟操作，用微量石英比色皿測得計算上清中的ΔA測定管=A1測定-A2測定=1.0091-0.7487=0.2604，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.9948-0.9678=0.027，ΔA1=ΔA測定管-ΔA空白管=0.2604-0.027=0.2334，沉淀中的ΔA測定管=A1測定-A2測定=1.08-0.6157=0.4643，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.9948-0.9678=0.027，ΔA2=ΔA測定管-ΔA空白管=0.4643-0.027=0.4373，按樣本質量計算酶活得：

上清：PC的酶活（U/g 質量）= 1607×ΔA1÷W×100(稀釋倍數)=1607×0.2334÷0.1×100=375073.8 U/g 質量；

沉淀：PC的酶活（U/g 質量)=1607×ΔA2÷W×4(稀釋倍數)=1607×0.4373÷0.1×4=28109.64 U/g 質量；

PC總酶活（U/g 質量）=1607×ΔA1÷W×100(稀釋倍數)+1607×ΔA2÷W

=1607×0.2334÷0.1×100+1607×0.4373÷0.1×4=403183.44 U/g 質量。

相關發(fā)表文獻：

[1] Esmail S. Kakey,Amez A. Ismael. Evaluation of Oxidative Stress Status in Aged Human in relation to some Diseases. International Conference on Pure and Applied Sciences. August 2018;

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